تست های تشخیصی عفونت های ویروسی
به گزارش روابط عمومی پایگاه اطلاع رسانی علوم آزمایشگاهی ایران، بسیاری از مطالعات و بررسی ها نشان داده اند که ویروس ها می توانند پس از ورود به سلول میزبان با میتوکندری تعامل کرده و عملکرد آن را مختل گردانند به ویژه اینکه برخی تحقیقات مشخص کرده اند که این اثرات می تواند تغییراتی در ساختمان میتوکندری و همچنین تغییراتی در مسیر تولید انرژی سلولی در زنجیره انتقال الکترون ایجاد نماید که این امر گاها باعث کاهش شدید انرژی سلولی در انتهای فرایند انتقال الکترون& خواهد شد. علاوه بر این، اکنون داده های جدید نشان می دهد که تعدادی از ویروس ها ممکن است روی مسیر میتوکندریایی آپوپتوز نفوذ ودر نتیجه باعث اثر در زنجیره تنفس در میتوکندری شوند.
مرگ سالانه هزاران نفر در اثر بیماری های عفونی ویروسی نگرانی های سلامتی عمومی جهانی را در پی داشته است. از پاندمی های وخیم وعفونت های بسیار مسری تا موارد معمول آنفلوانزا، در اغلب موارد پیش آگهی بالینی متکی برتشخیص زودهنگام عامل عفونی می باشد، بنابراین شناسایی مؤثر پاتوژن های ویروسی برای کمک به مهار انتقال، ایجاد درمان مناسب و نظارت بر پاسخ به درمان، موردنیاز بوده و منجر به مدیریت و کنترل مؤثر بیماری می شوند.
توانایی تست های تکثیر نوکلئیک اسیدی در تعیین لود ویروسی باعث محبوبیت بسیار آنها در تشخیص و مدیریت عفونت های ویروسی (مانند HBV، HCV، HIV، ویروسهای آنفلوانزا و …) شده است، به عبارت دیگر، این روش توانسته است طی تکثیر توالی هدف اسیدنوکلئیک ویروسی، مقدار کمی سازی را تا هزاران برابر افزایش دهد. امروزه در اغلب موارد، روش های PCR محور به عنوان روش مرجع یا”استاندارد طلایی” تشخیص از جمله هنگام غربالگری خون اهدا شده از نظر انتقال ویروسهای منتقل شده از راه خون CMV، HIV،& HCV و... در نظر گرفته می شوند.
توالی یابی نسل بعد& (NGS)
یکی از بزرگ ترین دستاورد های عصر نوین، تکنیک NGS است. علاوه بر توالی یابی ژنوم موجودات شناخته شده، از کاربرد های این تکنیک می توان کشف ویروس های جدید مسئول بیماری های ناشناخته انسان، ردیابی شیوع و پاندمی بیماری هایی مانند آنفلوانزا در راستای درک نحوه ی پیدایش و انتقال آنها را نام برد.
کشف توالی& یابی در دهه 1970 توسط سنجر و برل آغاز و سپس توسط ماکسام و گیلبرت، ادامه پیدا کرد. ماکسام و گیلبرت برای اولین بار قادر به توالی یابی الیگونوکلئوتید ها به روش پلیمریزاسون آنزیمی با استفاده از پرایمرهای نشانه گذاری شده توسط مواد رادیواکتیو شدند. آنها هنگام انجام توالی یابی، از دی‌دئوکسی نوکلئوتید (ddN) برای پایان دادن به مرحله ی گسترش پلیمریزاسیون استفاده کردند، در نتیجه روش خاتمه زنجیره یا دی‌دئوکسی نوکلئوتید نام گذاری شد.
اسپکترومتری جرمی (MS)
اسپکترومتری جرمی در حال حاضر یک معیار مهم در بررسی آزمایشگاهی کیفی و کمی، به ویژه در حوزه ی باکتری شناسی است. اساس اسپکترومتری جرمی مبتنی بر تبدیل نمونه به ذرات باردار (یون) توسط فرآیند یونیزاسیون است، در ادامه این یون ها بر اساس نسبت جرم به بار (m/z) جداسازی و توسط یک آشکارساز آنالیز می شوند. نتیجه به دست‌آمده با پایگاه داده مرجع (کتابخانه) موجود در سیستم، مقایسه شده و در قالب یک طیف (نمودار) قابل تفسیر عرضه می شود.
در آزمایشگاه های بالینی، روشهای (MALDI) matrix-assisted laser desorption ionization& و& & (ES)& electroscopy به دلیل پردازش مقادیر قابل توجهی از آنالیت، بیشترین موارد استفاده را در بین روش های یونیزاسیون دارند. جهت افزایش حساسیت، این روش های تجربی به تنهایی یا همراه با روشهای مولکولی دیگر مانند PCR به طور وسیع مورد بررسی قرار گرفته و نتایج بسیار خوبی را ارائه دادهاند. ترکیب این روشها (RT-PCR /ESI-MS) قادر به تشخیص پاتوژن های ویروسی است که معمولاً با روش های معمول آزمایشگاهی شناسایی نمی شوند. این روش ها همچنین داده های سریع و دقیق (گونه و زیرگونه ها) را در یک زمان کوتاه تولید می کنند.
آخرین تکنولوژی ها در جوامع& با منابع محدود
روش های شرح داده شده در فوق، عملکرد قابل توجهی در نجات زندگی هزاران نفر در کشور های توسعه یافته داشته اند، با این‌حال، مشکل در تهیه ی این تجهیزات و تجربه های فنی برای تشخیص دقیق در مراکز با منابع محدود، همچنان پابرجا است. درحالی‌که ابزار های گران قیمت مانند سیستم های PCR محور یا آنالیزور های جرمی فقط در آزمایشگاه های مرجع یا در مراکز نظامی وجود دارند، دسترسی به دستگاه های تست در مراکز مراقبت های ویژه یا درمانگاه های نزدیک به محل زندگی بیماران که بیش از 80 درصد از جمعیت فقیر را در اختیار دارند، با مشکل مواجه است، به عنوان مثال، سازمان بهداشت جهانی دستورالعمل هایی را برای نظارت بر اثربخشی داروهای ضد رتروویروس در بیماران مبتلا به HIV-1 در کشورهای در حال توسعه تنها با اکتفا به شمارش تعداد سلولهای CD4+& & و آزمایش ELISA به‌عنوان جایگزین تست های گران‌قیمت ایجاد کرده است. به جای سنجش میزان لود ویروسی، مقدار آنتی ژن p24 و فعالیت ترانس کریپتاز معکوس به ترتیب توسط روش فوق حساس p24 و آزمون ExaVir اندازه گیری می شود. متأسفانه عدم حساسیت آنها باعث درمان ناموفق و پیدایش سویه های مقاوم شده است.
مرگ سالانه هزاران نفر در اثر بیماری های عفونی ویروسی نگرانی های سلامتی عمومی جهانی را در پی داشته است. از پاندمی های وخیم وعفونت های بسیار مسری تا موارد معمول آنفلوانزا، در اغلب موارد پیش آگهی بالینی متکی برتشخیص زودهنگام عامل عفونی می باشد، بنابراین شناسایی مؤثر پاتوژن های ویروسی برای کمک به مهار انتقال، ایجاد درمان مناسب و نظارت بر پاسخ به درمان، موردنیاز بوده و منجر به مدیریت و کنترل مؤثر بیماری می شوند.
پاندمی های جهانی خطراتی جدی برای زندگی انسان هستند. درحالی که ویروسهای معین و شناخته شده ای از جمله ویروس نقص ایمنی انسان (HIV) و هپاتیت همچنان باعث مرگ میلیون‌ها نفر می شوند، ویروس های نوظهور مشکل زا بوده و چندین شیوع شدید در سالهای اخیر داشته اند؛ برای مثال در سال 2002 الی 2003 سندرم حاد تنفسی شدید ناشی از کرونا ویروس& (SARS-CoV)، در سال 2009 آنفلوانزای خوکی A(H1N1) و در سال 2014 تب خونریزی دهنده ی ابولا، مرگ هزاران نفر را در شرق آفریقا رقم زده اند.
PCR
انقلاب در زمینه ی تشخیص مولکولی توسط مولیس و فلونا در سال 1987 از طریق ایجاد& تکثیر اسید نوکلئیک طی واکنش زنجیره ای پلیمریزاسیون (PCR) به وجود آمده است. اساس این روش استخراج و تخلیص نوکلئیک اسید، تکثیر تصاعدی توالی هدف با استفاده از آنزیم پلیمراز مقاوم به دما و پرایمر های اختصاصی است. در نهایت آمپلیکون حاصل با استفاده از سیستم تشخیصی فلورسانس محور، شناسایی و نتیجه بر مبنای واحد بین‌المللی IU/ml گزارش داده میشود.توانایی تست های تکثیر نوکلئیک اسیدی در تعیین لود ویروسی باعث محبوبیت بسیار آنها در تشخیص و مدیریت عفونت های ویروسی (مانند HBV، HCV، HIV، ویروسهای آنفلوانزا و …) شده است، به عبارت دیگر، این روش توانسته است طی تکثیر توالی هدف اسیدنوکلئیک ویروسی، مقدار کمی سازی را تا هزاران برابر افزایش دهد. امروزه در اغلب موارد، روش های PCR محور به عنوان روش مرجع یا”استاندارد طلایی” تشخیص از جمله هنگام غربالگری خون اهدا شده از نظر انتقال ویروسهای منتقل شده از راه خون CMV، HIV،& HCV و... در نظر گرفته می شوند.
رایج ترین نوع روش های تکثیری مرسوم عبارتند از:& PCR در زمان واقعی (real-time PCR) (PCR کمی) و PCR رونویسی معکوس (RT-PCR). در حال حاضر هر دو تکنیک به معیارهای ارزیابی لود ویروسی تبدیل شده اند. درحالی‌که روش اول، DNA را در تمام واکنش ها در زمان واقعی اندازه می گیرد، در روش دوم، آنزیم ترانس کریپتاز معکوس ابتدا mRNA را تبدیل به cDNA کرده و با ساخت رشته ی مکمل، DNA حاصل را تکثیر می دهد. این روش همچنین مقدار RNA را اندازه گیری می کند. ترکیبی از هر دو تکنیک باعث افزایش حساسیت در شناسایی ویروس ها، به‌ویژه ویروس های آنفلوانزا می شود. پس از گزارش اولین مرگ ناشی از عفونت سندرم کرونای تنفسی در خاورمیانه (MERS-CoV) در سال 2012، سازمان بهداشت جهانی اخیراً یک روش پیشرفته و جدید از RT-PCR را تأیید کرده است.
یکی از بزرگ ترین دستاورد های عصر نوین، تکنیک NGS است. علاوه بر توالی یابی ژنوم موجودات شناخته شده، از کاربرد های این تکنیک می توان کشف ویروس های جدید مسئول بیماری های ناشناخته انسان، ردیابی شیوع و پاندمی بیماری هایی مانند آنفلوانزا در راستای درک نحوه ی پیدایش و انتقال آنها را نام برد.
کشف توالی& یابی در دهه 1970 توسط سنجر و برل آغاز و سپس توسط ماکسام و گیلبرت، ادامه پیدا کرد. ماکسام و گیلبرت برای اولین بار قادر به توالی یابی الیگونوکلئوتید ها به روش پلیمریزاسون آنزیمی با استفاده از پرایمرهای نشانه گذاری شده توسط مواد رادیواکتیو شدند. آنها هنگام انجام توالی یابی، از دی‌دئوکسی نوکلئوتید (ddN) برای پایان دادن به مرحله ی گسترش پلیمریزاسیون استفاده کردند، در نتیجه روش خاتمه زنجیره یا دی‌دئوکسی نوکلئوتید نام گذاری شد.
در حال حاضر روش Pyrosequencing روش منتخب در بین روش های NGS به حساب می آید. اساس این روش بدین گونه است که هنگام ورود نوکلئوتیدها به فرآیند پلیمریزاسیون DNA، مولکول های پیرو فسفات (PPi) تولید و رها می شوند. در ادامه PPi با کاتالیزور نوری لوسیفراز ترکیب و تولید نور کرده و در نهایت نور جمع آوری‌شده ثبت می شود. اگرچه پلت فرم Illumina به‌عنوان رایج ترین نوع این روش مورد استفاده قرار می گیرد، اما FLX454 تولیدی شرکت Roche، اولین تحلیل گر قابل عرضه با کارایی جامع در بازار بوده است و برای تعیین گونه ها، زیرگونه ها و واریانت های ویروس پاپیلومای انسانی (HPV) موجود در نمونه های دهانه رحم استفاده شده است. انواع دیگر سیستم ها، یون های هیدروژن آزادشده طی ورود نوکلئوتیدها به واکنش را شناسایی می کنند.
اسپکترومتری جرمی در حال حاضر یک معیار مهم در بررسی آزمایشگاهی کیفی و کمی، به ویژه در حوزه ی باکتری شناسی است. اساس اسپکترومتری جرمی مبتنی بر تبدیل نمونه به ذرات باردار (یون) توسط فرآیند یونیزاسیون است، در ادامه این یون ها بر اساس نسبت جرم به بار (m/z) جداسازی و توسط یک آشکارساز آنالیز می شوند. نتیجه به دست‌آمده با پایگاه داده مرجع (کتابخانه) موجود در سیستم، مقایسه شده و در قالب یک طیف (نمودار) قابل تفسیر عرضه می شود.
در آزمایشگاه های بالینی، روشهای (MALDI) matrix-assisted laser desorption ionization& و& & (ES)& electroscopy به دلیل پردازش مقادیر قابل توجهی از آنالیت، بیشترین موارد استفاده را در بین روش های یونیزاسیون دارند. جهت افزایش حساسیت، این روش های تجربی به تنهایی یا همراه با روشهای مولکولی دیگر مانند PCR به طور وسیع مورد بررسی قرار گرفته و نتایج بسیار خوبی را ارائه دادهاند. ترکیب این روشها (RT-PCR /ESI-MS) قادر به تشخیص پاتوژن های ویروسی است که معمولاً با روش های معمول آزمایشگاهی شناسایی نمی شوند. این روش ها همچنین داده های سریع و دقیق (گونه و زیرگونه ها) را در یک زمان کوتاه تولید می کنند.
یک ابزار کلیدی در مدیریت شیوع بیماری آنفلوانزا A، تشخیص تغییرات ژنتیکی یا جهش ها با استفاده از MALDI-TOF بوده است. کاربرد اسپکترومتری جرمی در تحقیقات ساختاری بیومولکول ها نشان دهنده کارآیی بالای MALDI-TOF-MS& همراه با نانوذرات مغناطیسی آنتی بادی در تشخیص ویروس های آنفلوانزا می باشد. نتایج بدست آمده از این روش ترکیبی همانند روش استاندارد طلایی مبتنی بر PCR است. سنجش چندگانه با استفاده از ترکیب دو ماشین قدرتمند& (PCR-MS)، تشخیص مقاومت دارویی طی درمان ضد ویروسی، وجود چندین ویروس در یک نمونه و همچنین عفونت های همزمان را ممکن می سازد.
روش های شرح داده شده در فوق، عملکرد قابل توجهی در نجات زندگی هزاران نفر در کشور های توسعه یافته داشته اند، با این‌حال، مشکل در تهیه ی این تجهیزات و تجربه های فنی برای تشخیص دقیق در مراکز با منابع محدود، همچنان پابرجا است. درحالی‌که ابزار های گران قیمت مانند سیستم های PCR محور یا آنالیزور های جرمی فقط در آزمایشگاه های مرجع یا در مراکز نظامی وجود دارند، دسترسی به دستگاه های تست در مراکز مراقبت های ویژه یا درمانگاه های نزدیک به محل زندگی بیماران که بیش از 80 درصد از جمعیت فقیر را در اختیار دارند، با مشکل مواجه است، به عنوان مثال، سازمان بهداشت جهانی دستورالعمل هایی را برای نظارت بر اثربخشی داروهای ضد رتروویروس در بیماران مبتلا به HIV-1 در کشورهای در حال توسعه تنها با اکتفا به شمارش تعداد سلولهای CD4+& & و آزمایش ELISA به‌عنوان جایگزین تست های گران‌قیمت ایجاد کرده است. به جای سنجش میزان لود ویروسی، مقدار آنتی ژن p24 و فعالیت ترانس کریپتاز معکوس به ترتیب توسط روش فوق حساس p24 و آزمون ExaVir اندازه گیری می شود. متأسفانه عدم حساسیت آنها باعث درمان ناموفق و پیدایش سویه های مقاوم شده است.
